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瞭望星空:大数据驱动细胞培养工艺开发

2020-03-17
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动物细胞培养技术跨越百年,从茹毛饮血初期的简单维持细胞存活,到快速发展阶段的支持细胞更优的生长表达,再到现代生物制药技术推动其在工业生产的广泛应用,细胞培养工艺开发的内容及诉求正发生着翻天覆地的变化,伴随着的细胞培养工艺开发方法也在出现变革。


细胞作为最小的生命单位之一,从内部看仅数十微米级的身躯中就涵盖了近万种的物质,以支持细胞的代谢及信号传导;从外部看,仅培养基中就有近百种物质,加上细胞自身的代谢物质,特别是随着现代工艺分析技术的应用,更多数据的产生,致使数据离散复杂不堪。


生命活体的不可预测性,以及细胞内外的海量数据产生,加剧数据分析的难度,运用现代大数据方法,对纷繁数据进行解析以指导工艺开发和优化,是现代生物工艺的必然趋势。特别是随着成本压力及产品质量的挑战不断升级,解密培养基和工艺参数,大数据的合理运用将有可能成为工艺开发的变革者。

回溯分析,海量数据挖掘确定关键参数

现代工业注重效率,特别是医药工业中的回溯性质量分析,是最快捷的方式获取产品生命周期中的变化趋势,进而对工艺参数进行调整优化,最大化产量及质量输出。


2015年,美国FDA和药企合作进行了一项工艺过程中的回顾性多变量分析(Multivariate Analysis,MVA ),通过对batch、Fed-batch和微泡模式的Fed-batch三个培养模式下各4个批次数据的综合分析,针对53个工艺变量(38个输入变量、15输出变量),在114个时间观察点产生的共计72504个数据,回溯性地寻找到对抗体产量及质量的关键性参数。



结合三种不同培养模式下,抗体的唾液酸化、岩藻糖化、半乳糖化和非半乳糖进行综合分析,同性的是,choline、histidine、isoleucine、phenylalanine、threonine和valine等物质对于唾液酸化的调节具有负效应,而对于半乳糖化则具有正效应。通过数据分析驱动这些物质的调节,对于工艺的优化起到了十分显著的效果。


此外,MVA分析方法也广泛应用于不同培养规模下的一致性检验。工艺放大一直是细胞培养的难度和痛点,通过对不同批次情况下的工艺参数和输出结果进行结果分析,可以有效检验不同培养批次下的工艺一致性,也可以为放大过程中的参数设置提供指导,确定更合理的操作空间。

主动出击,高通量实验设计驱动数据生成除了通过被动式的回溯分析,也可以通过高通量实验方式以主动出击。特别是在培养基筛选过程中,通过扩展筛选边界,加大筛选数量,结合海量数据的分析,可以快速开发出高效培养基,成为工业界越来越采用的方式。

Merck Serono 的研究组曾将一种基于主成分分析(Principle Component Analysis,PCA)的数据方法,应用到CHO细胞培养基的高通量筛选过程中。他们首先选取了培养基的43种关键成分,参考经典培养基及平台培养基的浓度,设置了低、中和高三种水平,然后通过特定实验设计软件将43种物质以三种浓度水平分配至16种预培养基中,这一点有效地保证了培养基配方的边界。


随后进一步通过实验软件,将这16种预培养基两两之间以不同溶度进行组合,进一步形成了376种混合形成的培养,随后将这376种培养基在96孔深孔板进行高通量实验,以细胞密度和蛋白产量作为输出值,将所有数据进行综合分析。最终376组条件中蛋白的产量分布为500-3500 mg/L,通过初步排序分析可以得到相对合理的培养基配方。更重要的是,基于最小二乘法的方式进行降维分析,可以寻找到对于细胞生长和蛋白表达最显著的影响因素。



通过对第十四天的产量分析,可以分析出柠檬酸铁、泛酸和缬氨酸等十多种物质对于产量提升具有正效应,丝氨酸、生物素和精氨酸等物质产品提升有负效应,通过进一步对这些物质的浓度调整,预测产量将有可能提升至4000mg/L左右,指导作用明确。



事实上,在PCA数据方法之前,基于QbD的DOE实验设计方式早就在工艺开发过程中得到广泛应用。大规模关键组分的筛选确认的PB方法,基于响应面设计的浓度优化,都需要多轮实验反复确认。基于混合补料的方法,不仅可以应用于自主培养基的开发,也可广泛应用于商业化培养基的开发,不同供应商直接差异化的培养基混合往往可以形成特定的效果。

基于数据分析的培养基开发固然高效,但是对于实验设计要求极高。实验参数设计合理,在较少的实验条件下即可得到优良结果。如果实验参数设计不合理,则需要加大实验量才可得到阳性结果,或者得不到理性配方。同时由于仍然是黑框操作,对于特定的问题优化针性不够。解密工艺数据的变革者已经到来

无论是既有数据的回溯分析,还是高通量实验中海量数据产生,工艺参数的检测将成为这样数据变革的核心。回顾那些摸瞎探路子的细胞工艺开发历史,如何充分解密整个细胞培养基及工艺成为一切工作的前提。


生化分析仪最早应用于葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和谷氨酸盐等代谢物质的分析,这些分析对于细胞培养过程的监控具有一定作用,但由于分析参数有限对细胞培养工艺的指导作用相对有限。随后更多分析技术得以发展,超高效液相色谱对氨基酸(UPLC)的分析对氨基酸的分析,液相串联质谱(LC-MS)对维生素的分析, 电感耦合等离子体-质谱法(ICP-MS)对微量元素的分析,气相色谱(GC-MS)对脂类的分析,已经其他等仪器的分析显著提升了对工艺开发的指导作用。


以上方法看似基础,然而需要相对复杂的分析样品前处理流程,对于初学者仍然具有一定的挑战;同时这些技术相互隔离,大量不同类型设备的采购对于企业来说压力重重,如需要全面分析,大部分依靠外包分析,费用高灵活度差;更重要的是,每个方法的分析时间长,仅应用于工艺结束后的全面回溯分析,在工艺过程中的监控和优化用发挥仍然不够。


为了充分整合培养基特定代谢物的分析,美国专注分析科学的908 Devices公司于2019年开发一款全自动细胞培养液分析仪Rebel,基于最先进的毛细管电泳串联质谱技术,在无需复杂的前处理情况下,可以7分钟内一次性分析包含所有氨基酸在内的33种培养基组分,全景式海量工艺数据的深入解密让细胞培养工艺开发事倍功半,成为当前细胞培养工艺开发的变革者。



基于革命性的技术突破全自动细胞培养液分析仪Rebel获得2019年全美分析科学家创新大奖,对于解密生物工艺的优势如下:
1.最便捷的分析:无需复杂的样品前处理,样品体积最少仅需要10μL,整个分析过程仅7分钟;2.最全面的分析:一次性分析覆盖所有20种天然氨基酸、6种维生素、5种生物胺和2种多肽共计33种物质;3.最准确的分析:与其他传统方法分析结果一致性强,变异度低,检出限低;4.最高效的分析:使用96孔板,无人值守全自动分析,测试卡自动校正维护方便,分析报告自动生成;5.最安全的分析:数据支持21 CFR Part 11-compliance,可在GMP/GLP放行条件下使用



全自动细胞培养液分析仪Rebel自去年年底在美国上市以来,数个全球TOP10药企已经共计采购十余台,目前该仪器正在国内进行全面推广,如有更多有关该仪器技术细节及购买事宜,请咨询汪先生(18917575439),或发送邮件至wangjie@youngseek.com。


可以预见的是,随着人类大数据时代的到来,生物制药的开发过程中都将极为倚重数据的分析,从海量的数据中寻找那么一抹星空,将是我们共同努力的方向。


参 考 文 献


1. Fermentanomics: Relating Quality Attributes of a Monoclonal Antibody to Cell Culture Process Variables and Raw Materials Using Multivariate Data Analysis,Biotechnol Prog,2015,31(6) :1585-1599.
2. A high-throughput media design approach for high performance mammalian fed-batch cultures, mAbs, 5:3, 501-511.


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