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Science:巨型噬菌体内发现全新基因编辑系统CRISPR-CasΦ,动植物细胞内均具有编辑活性​

2020-07-26
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CRISPR-CAS系统为细菌(古细菌)用以防御噬菌体入侵的一种最常见方法,在许多细菌体内作为适应性免疫系统发挥重要作用。自从人们发现了Cas9的应用潜力以来,这一系统迅速成为了炙手可热的基因组编辑工具,广泛获得了科学家们的青睐。


近日(2020年7月22日),来自CRISPR领域的先驱Jennifer A. Doudna的团队在Science发表一篇名为CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor研究中,报道了在巨型噬菌体基因组中发现的一种全新的基因编辑系统CRISPR-CasΦ。


该基因编辑系统由单个〜70千达尔顿蛋白CasΦ和一个CRISPR阵列组成,CasΦ由单个活性位点内进行CRISPR RNA(crRNA)加工和crRNA引导的DNA切割,靶向外来核酸。经研究验证,发现该系统在细菌、动植物细胞中均具有编辑活性。



CasФ属于Biggiephage进化枝上的一类Cas蛋白,其C端包含一个与TnpB核酸酶超家族同源的RuvC结构域(认为V型CRISPR-Cas蛋白从TnpB核酸酶超家族进化而来),但CasФ与V型CRISPR-Cas蛋白间的氨基酸同一性不足7%,与目前Type V发现较小的Cas14蛋白也明显不同。



经分子量测定,CasΦ的大小约为Cas9/Cas12的一半(70--80kDa),并且在CasФ的周边也未发现其他CRISPR蛋白。


基于以上情况,研究小组对CasΦ的功能(识别和靶向细菌内DNA的能力)进行了研究。研究人员选取了三个CasФ蛋白--CasФ-1,CasФ-2,CasФ-3进行体内的质粒转化试验,结果发现CasФ-2识别dsDNA依赖于PAM序列,进一步在试验中检测到了CasФ的RNA和一段缩短的CRISPR-array序列,没有检测到其他的非编码RNA如tracrRNA。这表明,CasФ是一类有功能的CRISPR蛋白且只需要单个RNA的引导下便可实现靶向功能。


随后,研究人员进行了体外试验中证明了CasФ能够在RNA的引导下对dsDNA进行有效的双链DNA的切割,并且发现CasФ切割CasΦ切割非目标链(NTS)的速度比目标链(TS)快。另外,还发现CasФ能够切割单链DNA而不能切割单链RNA。



为了研究CasФ能否用于人类基因组编辑,研究人员在HEK293细胞和模式植物-拟南芥中进行了进行了体内研究试验。研究结果发现CasФ能够对HEK293细胞和拟南芥原生质体的基因组进行有效地编辑,其中CasФ-2和CasФ-3能够有效地对HEK293的EGFP基因进行编辑,单个RNA引导的CasФ-2能够对30%的细胞进行编辑,这与之前所报道的CRISPR-Cas9,CRISPR-Cas12a和CRISPR-CasX的编辑水平相当,CasФ-2能够在植物细胞基因组上产生8-10bp的缺失。



因CasФ的体积更小,结构更紧凑的特性,研究人员认为CasΦ比目前的基因组编辑工具更具优势,尤其在递送上。这种Cas系统更容易被导入至细胞内进行基因组编辑,同时也为某些病毒载体(AAV)装载其他货物腾出更大的空间。


参考出处

1.https://sci-hub.tw/10.1126/science.abb1400

2.https://www.genengnews.com/news/tiny-cas-protein-huge-gene-editing-potential-thanks-megaphage/


文章转自公众号:佰傲谷BioValley


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