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治疗性抗体成药性开发评估之post-translational modification(PTM)

2020-07-31
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单克隆抗体(mAb)在多个治疗领域的新药开发中发挥着越来越重要的作用。在抗体产生和早期筛选过程中实施的高效和实用的高通量成药性开发工作流程对于选择最佳的候选分子是至关重要的(图1)。传统上,从早期发现到发展阶段,只有有限的标准(如抗原结合和动物模型的体内特性,包括安全性、药代动力学(PK)和药效学(PD))来选择候选mAb。如果没有广泛的表征来了解选定候选者的生化和生物物理属性,那么后期意外的修饰、稳定性都可能会导致项目进度延迟甚至终止。因此,在进入过程开发之前进行成药性可开发性评估是至关重要的。


 图1.   治疗性mAb发现,序列选择和可开发性工作流程


到目前为止,全球已有约100种抗体治疗药物获得监管机构的批准,其中,一些普遍首选的mAb药物特性已经开始出现(图2)。属性在这些范围内或更好的单克隆抗体预计具有相对较低的发展风险。

       

图2.  FDA/EMA批准的临床阶段mAb产品的质量属性


进行全面的可开发性评估,重点放在早期阶段的生化和生物物理特性评估上。一般是一个三步工作流程 (图3),步骤1是在计算机评估中,包括使用基于氨基酸序列的计算方法,以识别已知的降解热点和有问题的基序。第二步是进行深入的表征,以实验评估关键的生化和生物物理性质,如结构、稳定性、电荷分布、PTM、溶解性和疏水性。步骤3是进行有限的强制降解研究,首先,进一步确认步骤1和步骤2中确定的热点,其次,揭示步骤1中确定的候选特定降解热点。强制降解研究还提供额外的稳定性信息来对候选物进行排序。步骤2和步骤3可以同时进行,以允许在短时间内对mAb候选物进行彻底评估。


图3. 早期阶段mAb生化和生物物理特性评估的一般流程


在mAb的生产过程中,不同的理化因素易产生各种翻译后修饰(post-translational modification,PTM)变异体,如糖基化、氧化、脱酰胺、异构化等,这些PTM可能引起抗体理化性质变化,这些变化会对mAb效力、免疫原性和稳定性产生负面影响(图4)。因此mAb的PTM与产品的安全性、有效性和稳定性息息相关。小编就治疗性mAb常见的PTM进行一个简单的介绍。

图4. 治疗性抗体常见的PTM及对mAb的影响


1. 脱酰胺化

Asn脱酰胺化是mAb中最常见的降解途径之一,特别是CDR中的Asn残基(图5)。Asn紧随其后小而灵活的甘氨酸(Gly)残基(NG基序),对脱酰胺化非常敏感。另外,蛋白质结构可以对ASN脱酰胺化产生重大影响,这已经在不是NG基序中的ASN容易脱酰胺的情况下被证明。CDR中的ASN去酰胺化可能导致抗原结合亲和力的降低,因此CDR中的脱酰胺化在给药后会导致活性丧失。除了较敏感的NG之外,CDR中的NS,NT也应在计算机评估中突出显示,以确认脱酰胺的可能性。


图5. Asn 脱酰胺反应机制


脱酰胺作用最好通过肽图分析和质谱测试。在某些情况下可以应用阳离子交换HPLC(CEX-HPLC)或毛细管等电聚焦(cIEF)来监视此属性,因为酰胺基的丢失会导致蛋白质净电荷的变化。这可能是存储或样品应力增加电荷异质性的一种来源。据报道,增加的电荷变体不仅影响稳定性,还可能影响粘度。应当注意,CEX-HPLC或cIEF的通量方法比肽图分析要高得多,而且肽图分析是比较繁琐的的分析方式。


2. 异构化

ASP异构化是mAb另一种常见的降解途径。与脱酰胺化类似,CDR中的Asp残基通常容易异构化,特别是DG位点。DH, DS的Asp异构化也被报道,这表明其他因素的参与,如氨基酸残基的柔韧性,大小和结构。CDR中Asp异构化也可能导致抗原结合亲和力的降低。为了降低开发风险,在进行计算机评估时应突出DG,其次是DS, DH, 并在扩展表征和强制降解过程中应进一步评估。要检测ASP异构化PTM,需要进行高分辨率质谱分析(MS)方法(例如MS / MS与肽图结合)是必需的。这个属性在药物开发过程中必须跟踪,因为它可以随着时间的推移在存储中增长,并且如果位于分子的活性部分(例如CDR),也会影响药物的活性。另外,该修饰的速率可受配方影响。因此,了解异构化速率和配方之间的关系通常很有利的,这样可以控制异构化速率。


3. 氧化

蛋氨酸(Met)和色氨酸(Trp)残基经常发生氧化。研究表明,重链CDR2、和骨架区Met的氧化不影响抗原结合。然而,更高的氧化水平或对抗原结合更关键的位置可能会产生负面影响。靠近CH2-CH3结构域界面和FcRn、Protein A和Protein G结合位点的两个保守的Met残基被证明是容易氧化的。这些Met残基氧化导致热稳定性降低,增加聚集性,降低 CDC效应,降低与FcRn的结合亲和力,并缩短体内半衰期。CDRs中Trp残基的氧化会导致效价降低、热稳定性降低和聚集倾向增加。Trp的氧化也被证明会导致mAb溶液的黄色,这是由于Kynurenine的形成。总体而言,CDR中的Met和Trp应仔细评估,以确定其敏感性,并在必要时在加工和配制过程中实施适当的控制策略。监测蛋氨酸氧化的最有效方法是肽图分析和质谱分析。像蛋氨酸氧化一样,肽图分析也是监测色氨酸氧化的主要方法。另外, 疏水相互作用色谱法(HIC)也可用于监测色氨酸氧化,因为CDR中色氨酸的氧化通常会改变与HIC色谱柱的结合潜力。HIC比肽图分析具有更高的通量以及较少量的样品。


4. 未配对的Cys

mAb在CDRs中可能含有不配对的半胱氨酸(Cys)残基。未配对的半胱氨酸很容易被细胞培养液中的游离半胱氨酸修饰,并被证明降低了抗原结合亲和力。由于半胱氨酸侧链的高反应性,CDRs或其他区域的未配对的半胱氨酸都应予以消除。据所知,上市的治疗性抗体药物上还没有抗体的可变区中含有额外的半胱氨酸。


5. 糖基化

在众多的翻译后修饰中,糖基化修饰是最重要和最复杂的修饰之一,也是评价抗体的关键质量属性之一。mAb除了在Fc区有保守的N-糖基化位点外(Asn-297),在可变区出现N-糖基化序列(NXS/T,X不能是P)的情况并不少见。但是目前在可变区糖基化的上市药物仅在一种治疗性抗体中发现,即西妥昔单抗(Erbitux)。可变区糖基化对抗原结合有不同的影响,但对体内半衰期没有影响。可变区糖基化增加了抗体效力与后期可开发一致性的不确定性。Fab末端半乳糖糖基化的水平越高,通过α1,3-半乳糖和唾液酸化进一步进行半乳糖化的可能性就越大。Fab相关的寡糖中α-1,3-半乳糖(Gal)糖基化已被证明具有免疫原性。


小编总结

PTM构成了抗体产品质量属性系列,应在成药性开发性评估期间予以考虑,尤其是当它们对抗体药物的治疗和安全性产生影响时。鉴于PTM对mAb药物的影响,科研工作者利用并优化现有的技术手段进行检测,以实现对mAb药物的质量控制。随着人们对PTM影响的不断深入了解,通过优化抗体的PTM, 进而获得优良生物活性、安全性高以及稳定性能好的均一性抗体生物制品。


参 考 文 献

1. Structure, heterogeneity and developability assessment of therapeutic antibodies

2. Predicting antibody developability profiles through early stage discovery screening3. Deamidation and isomerization liability analysis of 131 clinical-stage antibodies.4. Developability assessment during the selection of novel therapeutic antibodies.


文章转自公众号:生物制药小编


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