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“沉默杀手”:CAR巨噬细胞用于新冠病毒清除治疗

2020-08-03
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目前,针对新型冠状病毒性肺炎(COVID19)的疫苗研究正在火热进行中,但针对重症COVID19药物研发依然是棘手的科学难题,目前尚未有特效的针对重症COVID的特异性药物。目前的研究显示,重症COVID19患者体内存在SARS-COV-2的中和抗体,表现出过度的促炎症因子释放风暴,提示患者体内的免疫功能紊乱。目前,以血浆疗法为代表的抗体疗法在随机对照研究中未显示出积极的治疗效果,其治疗价值有待进一步明确因此,重症COVID19的药物及疗法开发对全球科学界提出严峻的挑战。


近日(7月27日,第二军医大学基础医学院胡适团队在bioRxiv预印版平台上公开提交了最新的研究手稿,题为“CAR Macrophages for SARS-CoV-2 Immunotherapy”。该研究手稿公开了用于SARS-COV-2病毒清除的嵌合抗原受体(CAR)巨噬细胞的设计、制备和表征。在该研究中,除了常见的基于CD3和Fc受体的CAR设计外,研究团队在CAR受体设计的基础上,巧妙地构建一种利用巨噬细胞清除细胞碎片的特殊受体(TAM家族受体成员MERTK)作为嵌合抗原受体的胞内信号结构域的构建方式(沉默型CAR)。研究结果显示,沉默型CAR巨噬细胞不仅和其他CAR细胞一样具有较强的病毒吞噬清除功能,且并不引起细胞因子的释放,是一种适合重症COVID19的治疗的潜在细胞疗法。为了第一时间让读者了解论文信息,小编利用谷歌软件进行了全文翻译,以飨读者。如有不妥请参考原文:



前缺乏用于治疗冠状病毒2019COVID-19)的靶向疗法,尤其是严重病例由于巨噬细胞具有独特的效应功能,可以作为对入侵病原体的一线防御,因此我们将人类巨噬细胞与嵌合抗原受体(CAR)遗传武装,以重新编程其对SARS-CoV-2的吞噬活性在研究了具有不同细胞内受体结构域的CAR构建体后,我们发现尽管MERTKCARMERTKMEGF10FcRγCD3ζ的不同,其胞质域不触发抗原特异性细胞吞噬作用或杀伤作用,这些CAR导了相似的SARS-CoV-2体外清除率。值得注意的是,我们表明CARMERTK巨噬细胞可显着降低病毒体载量,而不会上调促炎性细胞因子的表达。这些结果表明,CARMERTK可在巨噬细胞中发挥免疫沉默清除剂的作用,并为进一步研究CAR治疗COVID-19的患者,特别是那些患有高炎症高危病例的患者,铺平了道路。


前言


2019年冠状病毒病(COVID-19)大流行已导致多器官疾病性肺炎的住院治疗突然显着增加,并导致全球300,000多人死亡。COVID-19是由新型严重急性呼吸综合征冠状病毒2SARS-CoV-2)引起的,这是一种新型包膜RNAβ冠状病毒。SARS-CoV-2感染可能是无症状的或引起多种症状,从上呼吸道感染的轻度症状到威胁生命的败血症。COVID-19的表现包括无症状携带者和特征在于败血症和急性呼吸道衰竭的暴发性疾病。大约5%的COVID-19患者(包括20%的住院患者)出现严重的症状,需要重症监护。超过75%的COVID-19住院患者需要补充氧气。COVID-19的病死率因年龄而异,从517岁的患者中每1000名患者中有0.3例死亡,到每人304.9例中有死亡。85岁或以上的患者中有1000名患者。在重症监护病房住院的患者中,病死率可达到40%。


目前尚无可用于SARS-CoV-2的人类疫苗,但是大约有120种候选疫苗正在开发中。在开发有效疫苗的过程中,必须克服许多挑战,例如技术壁垒,大规模生产和监管的可行性,法律壁垒,潜在的免疫持续时间以及因此赋予免疫力所需的疫苗剂量数量以及抗体依赖性增强作用。此外,还需要考虑另一个复杂的领域:COVID-19的药物开发,尤其是对重症或晚期疾病患者的治疗。据报道,与常规护理相比,地塞米松疗法可降低需要补充氧气的患者28天死亡率(21.6%比24.6%;年龄调整率比率,0.83[95%CI,0.74-0.92]),据报道瑞姆沙韦将恢复时间(医院分泌物或无需补充氧气)从15天缩短到11天。在103名COVID-19患者的随机试验中,恢复性血浆并没有缩短恢复时间。正在进行的试验正在测试抗病毒疗法,免疫调节剂和抗凝剂。但是,没有推荐针对COVID-19的特异性抗病毒治疗。


嵌合抗原受体(CARs)是将T细胞活性重定向至特定靶标的合成受体。CAR构建体在细胞外结构域中包括单链可变片段(scFv)或结合受体/配体形式的抗原识别结构域,提供支架和信号转导的跨膜结构域以及来自T细胞受体的细胞内结构域(TCR)和刺激T细胞活化的共刺激分子。基于长期以来对利用巨噬细胞以对抗肿瘤生长的兴趣,已经开发了用CAR工程化的人类巨噬细胞,并对其抗肿瘤潜力进行了表征。巨噬细胞是先天免疫系统的关键效应物,负责感知和响应微生物威胁并促进组织修复。因此,我们假设CAR巨噬细胞可用于对抗SARS-CoV-2。然而,已发现高炎症性巨噬细胞反应对宿主有损害,特别是在严重感染(包括SARS-CoV-2)和细胞因子释放综合征(CRS)中,这也是与CAR-T细胞疗法相关的最重要并发症,引发有关使用CAR巨噬细胞清除病毒的安全性的问题。


在本报告中,我们基于对S蛋白的识别,开发了一系列嵌合抗原受体,并测试了它们诱导SARS-CoV-2病毒粒子吞噬的能力有趣的是,我们报道了一个具有TAM受体家族的MERTK胞内结构域的CAR与其他CAR相比,在基于抗原的细胞模型中未显示出明显的杀伤作用,但确实显示出SARS的抗原特异性清除-CoV-2病毒体在体外无促炎细胞因子的分泌。



为了基SARS-CoV-2刺突蛋白的识别来编程吞噬,我们在研究中使用了CAR设计作为合成受体策略。构建合成受体以包含衍生自识别病毒刺突蛋白CR3022的抗体的scFv,据报道该抗体与SARS-CoV-2 S糖蛋白的受体结合结构域具有高亲和力,并具有CD8跨膜T细胞中存在于αCD19CAR中的结构域。对于胞质结构域,我们在研究中使用了Fc受体的常见γ亚基(CARγ),MEGF10CARMEGF10),MERTKCARMERTK)和CD3ζCARζ)(图1a)。这些胞质结构域能够促进巨噬细胞的吞噬作用。



接下来,我们使用慢病毒载体技术通过临床验证的技术在人巨噬细胞THP-1细胞中表达融合构建体。将包含各种融合构建体的cDNA序列克隆到第三代慢病毒载体中,其中CMV启动子被EF-1α启动子替换。将细胞外MYC表位克隆到受体中以允许通过流式细胞术检测。慢病毒载体上清液能高效转染THP-1细胞(图1b)。用基于细胞的测定法测量表达不同CAR受体或缺乏细胞内结构域的截短CAR受体(CARΔ)的人巨噬细胞THP-1细胞系的吞噬潜力。与先前的报道一致,CAR巨噬细胞和对照未转导(UTD)巨噬细胞未显示出293细胞的明显吞噬作用。然而,CARMEGF10CARγCARζ细胞而不是CARMERTKCARΔUTD巨噬细胞以S特异性方式吞噬了带有Spike293细胞(图1c)。CAR导的巨噬细胞吞噬作用已通过基于荧光素酶的杀伤试验进一步证实,我们的数据表明CARMEGF10CARγCARζ细胞以抗原特异性方式消除了表达S蛋白的293T细胞(图1D)。有趣的是,CARMERTKUTD巨噬细胞的杀灭作用没有差异。我们的数据进一步表明,所有合成受体均具有结合S蛋白的能力(图1F);因此,吞噬作用和裂解作用的差异并不是由于对S蛋白的亲和力。



尽管目前尚无证据表明SARS-CoV-2可以感染有或没有IgGsTHP-1细胞,但在以前的研究中,THP-1细胞已显示支持抗体导的SARS-CoV感染的增强。因此,我们寻求确定合成受体是否有助于SARS-COV-2作为宿主细胞进入巨噬细胞,因为CAR构造的胞外域具有直接结合S蛋白的能力。带有冠状病毒S蛋白的复制缺陷型VSV颗粒忠实地反映了包括SARS-CoV-2内的冠状病毒进入宿主细胞的关键方面,因此我们采用了带有SARS-2-SVSV假型来研究SARS-CoV的细胞进入。们的数据表明,Vero E6细胞容易受到SARS-S驱动的进入(图2a);然而,在有或没有合成受体的THP-1细胞中都没有检测到感染的迹象。


抗体介导的吞噬作用和病毒粒子的内在化是巨噬细胞针对病原体发挥抗病毒活性的重要机制。但是,使用针对SARS-CoV-2开发的吞噬作用测定法,我们观察到UTD细胞直接接触病毒粒子时吞噬活性水平较低。当检测中的吞噬细胞是CARΔ细胞而不是UTD巨噬细胞时,吞噬活性并未显着提高,这表明仅CAR的细胞外结构域不足以诱导强烈的病毒体内在化。THP-1细胞对CARγ,CARMEGF10和CARζ介导的SARS-CoV-2吞噬作用的作用明显强于CARΔ(图2b)。出乎意料的是,我们还观察到CARMERTK细胞中病毒体的强烈内化,而对表达S蛋白的293T细胞没有特定的吞噬或裂解作用。由于所有CARs都具有诱导SARS-CoV-2病毒颗粒吞噬的能力,而没有感染迹象,因此这些实验强烈提示CAR巨噬细胞迪欧SARS-CoV-2病毒颗粒的清除。


由于在严重COVID-19患者中观察到的全身细胞因子谱与巨噬细胞活化综合征患者中观察到的相似,因此在多重细胞因子分析中进一步分析了用病毒体处理过的不同CARs的THP-1细胞的培养上清液(图2c)。在SARS-CoV-2处理THP-1细胞后,我们观察到细胞因子IL-6,IL-8和TNF-α的分泌略有增加,但对于GM-CSF,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-5,IL-8,IL-10和IFN-γ并没有确定的可分辨模式。CARΔ细胞显示出与UTD巨噬细胞相似的细胞因子谱。值得注意的是,我们观察到在SARS-CoV-2处理过的CARγ和CARζ细胞中,不仅强烈增强了IL-6,IL-8和TNF-α的诱导,而且还诱导了IFN-γ和IL-10的诱导。但是,对于CARMERTK细胞,我们没有观察到细胞因子的显著变化。


我们进一步使用基于transwell的共培养模型来评估CAR巨噬细胞在SARS-CoV-2感染中的保护作用(图3a)。所有表达CAR的巨噬细胞均有效抑制SARS-CoV-2-S假型病毒感染Vero E6细胞。有趣的是,CARΔ细胞尽管具有相似的结合S蛋白的能力,但在感染测定中没有显示保护作用,这表明细胞内信号结构域对于CAR巨噬细胞清除病毒粒子是必需的。


讨论


巨噬细胞具有吞噬功能,抗原呈递能力和灵活的表型,可以防止感染并清除人体的破旧或异常细胞。肺实质的先天免疫反应的特征是将骨髓来源的单核细胞分化为巨噬细胞,作为抵抗肺部病原体的一线防御。通常,单核细胞/巨噬细胞能够显着限制病毒复制。对于流感病毒,疱疹病毒和寨卡病毒,已显示出在病毒感染期间引起的单核细胞增强的促炎信号分子水平和抗病毒反应。此外,最近有人提出,某些COVID-19患者具有增强的促炎性巨噬细胞活性,从而加速了炎症性细胞因子和趋化因子的产生,并且大多在预后较差的受试者中观察到。


据我们所知,尚未针对COVID-19研究基于合成细胞的免疫疗法。已经证明表达CAR的T细胞是治疗B细胞癌患者的非常有效的方法。利用工程巨噬细胞的力量来开发针对实体瘤的新疗法非常受关注,因为T细胞无法穿透实体瘤和抑制性肿瘤微环境常常阻碍了CAR-T细胞疗法的发展。与先前的报道一致,具有胞浆免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)的CAR受体能够触发巨噬细胞特异性吞噬和杀死表达抗原的细胞。这些CAR巨噬细胞在我们的数据中也显示出SARS-COV-2病毒粒子的强烈吞噬作用。然而,该作用伴随着促炎细胞因子IFN-γ,IL-6和IL-8的分泌增加。在CAR-T细胞疗法中,工程改造的T细胞扩增通常伴随着高水平的CRS,其循环水平的干扰素(IFN)-γ,粒细胞集落刺激因子(G-CSF),IL-6,IL-8和IL-10。最近的报道表明,宿主来源的单核细胞/巨噬细胞和CAR-T细胞的相互作用在CRS病理生理学中起着重要的作用。这是令人感兴趣的,因为相似的炎性细胞因子的血清水平升高与COVID-19的严重程度和死亡有关。有趣的是,在用SARS-CoV-2病毒粒子处理的CARγ和CARζ细胞中,IL-6,IL-8,TNF-α,IFN-γ和IL-10的分泌显着升高,表明这些CAR巨噬细胞可能不适合用于重症患者或晚期COVID-19患者。


先前的研究表明,人类免疫细胞(例如THP-1细胞系)容易感染SARS-CoV2。我们没有观察到任何证据表明我们的SARS-CoV-2假型病毒感染了THP-1细胞。此外,THP-1细胞对病毒粒子的吸收非常低,即使具有能够结合S蛋白的截短的CAR,也表明THP-1细胞没有天生地吞噬病毒粒子。值得注意的是,CARMERTK在我们的测定中在THP-1细胞中表达时,在先前的报告中被认为是不成功的受体,并且在THP-1细胞中表达时对靶细胞没有细胞杀伤作用,其病毒清除能力类似于CARγ和CARζ。我们的数据进一步支持CARMERTK介导“免疫沉默”的病毒粒子去除,这不会引起促炎反应。


MER酪氨酸激酶(MERTK)与TRYO3和AXL一起属于TAM受体酪氨酸激酶(RTK)家族。这些受体可以被复杂的配体激活,该配体由磷脂酰丝氨酸(PtdSer)组成,通过维生素K依赖性蛋白配体Gas6或Protein S与RTK连接,在先天免疫细胞中起关键作用。Gas6具有结合所有三个受体的能力,而蛋白S是MERTK和TYRO326的特异性配体。凋亡细胞,外泌体和细胞碎片是PtdSer成分的主要来源。在某些情况下,PtdSer组分还由活细胞(包括T细胞)上暴露的PtdSer的斑块提供。TAM受体家族成员的激活通常会在先天免疫细胞中诱导抗炎,体内稳态反应,从而减少因摄入“自我”而引起的过度炎症和自身免疫反应。但是,先前的研究还提出,包膜病毒可以通过PtdSer依赖性过程(称为“凋亡拟态”)劫持TAM受体,以促进附着和感染,并充当有效的TAM激动剂,进而抑制靶细胞中的I型IFN反应。在我们的研究中,表达带有MERTK胞质结构域的合成受体的THP-1细胞对病毒感染具有相对抗性,但可诱导显着的病毒体清除。应当指出,我们的研究使用了非常简单的感染模型。因此,该测定缺乏许多生理和病理因素,例如IgG或补体介导的免疫复合物,可能会干扰工程细胞的行为。当然,表达合成受体的细胞可以被进一步工程化和发展以实现精确控制。


总之,我们的数据表明基于CAR的合成方法适用于COVID-19治疗。除了可以通过CAR巨噬细胞直接清除病毒体之外,我们还发现有证据表明基于MERTK的CAR受体不会诱导炎症细胞因子水平的进一步上调,从而增加了CAR巨噬细胞在严重COVID-19中用作有效治疗剂的可能性。


原文:https://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.07.26.222208v1


文章转自公众号:生物制药小编


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